双脱氧末端终止法的主要操作步骤

双脱氧末端终止法的主要操作步骤

发布时间:2017-06-24

    双脱氧末端终止法的主要操作步骤有:

    1.获得待测DNA片段的单链模板:一般采用基因工程的方法以获取一定数量的单链待测DNA模板。可将待测DNA片段与噬菌体M13DNA进行重组,然后将其导入大肠杆菌进行增殖,M13噬菌体一般以单链DNA形式透出细胞再感染新的细菌,故此可获得单链DNA模板。

    2.合成寡核苷酸引物:利用DNA合成仪合成一段与待测DNA片段的3’-端互补的寡核苷酸引物。

    3.模板-引物杂交:将待测单链DNA模板与寡核苷酸引物混合,并进行保温处理,使引物与DNA单链模板的3’-端进行杂交。

    4.互补链的延长和终止:将上述杂交混合液分为四份,每份混合液中均加入DNA聚合酶,四种dNTPS,一种带放射性同位素标记的脱氧核糖核酸(如α- 32P-dATP)。此外还需分别加入一种双脱氧核糖核酸(ddATP,ddGTP,ddCTP或ddTTP)。然后在适当温度条件下延伸互补链,就可得到四组分别以A、G、C、T、终止的长短不一的互补链的混合物。

    5.电泳分离:将四组含有长短不等的反应混合物在同一聚丙烯酰胺凝胶板上进行电泳,即可将只相差一个核苷酸的寡核苷酸链分离开。

    6.放射自显影:将电泳凝胶进行放射自显影,即可得到放射自显图谱,通过该图谱即可直接读出核苷酸的排列顺序。


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